LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
”Kromatografi Lapis Tipis Asam Amino”
DISUSUN OLEH :
Nama : Imelda
Gustia Ningsih
Nim :
06091010008
DOSEN PENGASUH
: Drs. Made Sukaryawan, M.Si.
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA
JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
INDRALAYA
2012
LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA
I.
NOMOR PERCOBAAN : VII
II.
NAMA PERCOBAAN : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ASAM AMINO
III.
TUJUAN PERCOBAAN : 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino
dengan
Kromatografi Lapis Tipis
2. Mengetahui harga Rf asam amino
IV. LANDASAN TEORI
Kromatografi adalah
suatu metoda pemisahan campuran senyawa atau komponen tersebut antara dua fasa
yaitu
a. Fasa diam ( absorben atau lapisan penyerap )
Betindak sebagai pemisah campuran tersebut. Contoh pelarut yang
digunakan adalah slika gel, aluminium oksida, selulosa. Namun yang paling
banyak digunakan adalah slika gel dan alumunium oksida karena kadar air yang
digunakan berpengaruh terhadap daya.
b. Fasa gerak ( Eluen )
Bertindak sebagai pembawa campuran tersebut . komponenkomponen campuran
akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam
sehingga terjadi pemisahaan.
Prinsip KLT adalah untuk menentukan atau memisahkan campuran senyawa
menjadi komponen-komponennya secara tepat. Mudah dan cepat berdasarkan
perbedaan dari daya serap masing-masing komponen berdasarkan perbedaan
distribusi.
Kromatografi lapis tipis
merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak
asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis
dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak
banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya
sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak.
Kromatografi jenis ini
menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben
yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya
kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di
atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi
lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat,
etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform.
Sebagai persiapan untuk
menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih
dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan
kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk
praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata
maka lempeng dikeringkan.
Kromatografi lapis tipis (KLT)
seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya,
kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas,
prosesnya mungkin memerlukan waktu kira-kira setengah jam. Kromatografi lapis
taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium.
Teknik KLT ini dikembangkan
pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng
kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap
sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai
kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan
sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali
senyawa-senyawa yang terpisahkan.
Pemilihan sistem pelarut dan
komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan
digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu
mikro-syiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu
bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 – 10
g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap.
Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal
searah gerakan pelarut. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga
dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam
kromat seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu
zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh
lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan pengerokan
setelah pemisahan selesai.
Kromatografi lapis tipis
memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya :
1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi
tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka
hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan.
2. Tidak memerlukan waktu yang banyak
3. Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta
terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT
4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam
pelarut.
Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun
anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih
sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat.
Pada KLT terdapat adsorben
yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai
adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide), kieselguhr
(iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang
sering dipakai adalah silika gel.
Selain terdapat fasa stationer
atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam
kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut
organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik
seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, kloroform (kloroform
yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum.
Kromotografi lapisan tipis dikembangkan oleh Egon Stahl dengan
menempelkan adsorben pada lempengan gelas, sehingga merupakan lapisan. Komponen
yang lebih kuat diserap oleh adsorben akan lebih lambat naiknya dari komponen
yang kurang diserap, adsorben akan lebih cepat naiknya ke plat, sehingga pada
plat akan terdapat komponen-komponen yang tersusun sepanjang plat. Kondisi
optimum suatu pemisah merupakan
hasil kesesuaian antara absorben dan eluen.
Untuk mengidentifikasi komponen yang satu dengan yang lainnya digunakan
faktor refensi (Rf).
Jarak ynag ditempuh komponen dapat diperbesar menggunakan pelarut polar,
sebaliknya ukuran identitas bercak dapat untuk mempekirakan kadar dari
masing-masing komponen yang terdapat dalam campuran. Untuk zat yang bersifat
asam / basa kuat yang tidak dapat dilakukan dengan kromotografi kertas dapat
dipisahkan dengan KLT.
Pemisahan pada KLT didasarkan pada:
- Penyerapan, pembagian, pertukaran ion, dan gabungan dari ketiganya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi Rf adalah: Adanya ion, Kesamaan larutan
lainnya, Adanya kation dlam kosentrasinya.
Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf: Sifat dari penyerap dan
derajat aktivitas, Struktur kimia dari senyawa dipisahkan, Kerapan dari satu
pasang penyerap, Pelarut
V.
ALAT DAN BAHAN
1.
alat :
a) pelat kromatografi
b) selembar kaca
c) penggiling
d) beker gelas
e) pengaduk magnetik
f) gelas ukur
g) pipet tetes
h) penyemprot
i)
penggaris
j)
pensil
|
2.
Bahan
a) silika gel
b) pelarut etanol
c) larutan ninhidrin
d) larutan Kuprinitrat
e) larutan asam amino (arginin, asam glutamate,histidin dan alanin)
f) aquadest
|
VI.
PROSEDUR PERCOBAAN
Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih,
terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan
50 ml air dengan pengaduk magnetik
sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat
Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu.
Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh
dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam.
Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling
banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1
cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat
diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5
cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya
permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh
(ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan
ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan.
Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.
Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan
tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.
Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup
dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat
dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang
diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi
dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap
eluen.
Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino
dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang
dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi
diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi
tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada
suhu kamar.
Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan
ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5,
juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali.
Kemudian plat dikeringkan pada 60oC
selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih
lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.
(b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan
dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot
kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin
yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka
sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh
terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel.
Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta
irreversibel.
VII.
HASIL PENGAMATAN
Sampel
|
Jarak
|
Warna
|
Arginin
|
7,8 cm
|
Biru
|
Asam Glutamat
|
8,5 cm
|
Merah
|
Histidin
|
-
|
-
|
Alanin
|
3 cm
|
Ungu
|
Sampel
|
-
|
-
|
VIII. REAKSI
KIMIA
IX. ANALISA DATA
Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara
jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal
hingga garis akhir.
1. Pada Arginin,
2. Pada Asam Glutamat,
3. Pada Alanin,
X.
PEMBAHASAN
Pada
percobaan mengennai kromatografi lapis tipis ini dilakukan untuk mengetahui
harga Rf dari beberapa macam asam amino yang diujikan. Asam amino yang diuji dalam percobaan ini
ialah arginin, asam glutamate, histidin dan alanin . keempat asam amino ini
mewakili masing-masing dari golongan asam amino
Pada
percobaan ini kaca yang digunakan harus benar-benar bersih bebas dari lemak
oleh karena itu dibersihkan menggunakan deterjen, dan dikeringkan di udara. Fase gerak dan fase diamnya adalah etanol dan
silica gel.
Pada
awalnya dilakukan pembuatan lapisan dari silica gel. pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 25 gr
silika gel dengan 50 ml air yang dituangkan kedalam plat kaca. Kami melakukan pengulangan
beberapa kali karena lapisan silica gel kami pada awalnya terlalu tebal
sehingga mudah hancur dan juga permukaannya bergelombang. Oleh karena itu untuk
membuat lapis tipisnya frame pada pinggiran kacanya harus dibuat rata serta
pada saat penarikan seilikanya harus dalam satu kali tarikkan agar permukaannya
tidak bergelombang.
Pada penetesan asam amino perlu dilakukan
secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam
amino yang kami lakukan dengan jarak 1,5 cm dari tepi bawah. Eluen yang akan dijalankan diukur
sepanjang 10 cm. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap
dijalankan ( dengan etanol). Eluen pun berjalan tergantung dengan
lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu
tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu,
pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila
sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan.
Untuk
melihat bercak noda dari jarak asam amino dapat disemprotkan dengan larutan
ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak
jalannya asam amino dengan menimbulkan warna merah pada asam amino. Kemudian,
plat kacanya harus dikeringkan.
Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu
adanya penyemprotan larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga
terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya
Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya
silika gel yang dibuat. Setelah
disemprot, pada silica gel muncul bercak – bercak atau noda. Noda yang
dihasilkan untuk argini berwarna biru, asam glutamat merah sedangkan alanin
berwarna unguuntuk histidin dan larutan sampel tidak menimbulkan bercak warna
sehinggga dapat disimpulkan bahwa larutan sampel adalah histidin.
Dari
analisa data yang diperoleh, Rf untuk teori dan praktek agak berbeda. Hal ini
dapat saja disebabkan oleh :kesalahan pada saat membuat lapisan silika
gelnya, kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang
digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta
dengan jarak yang terlalu dekat.
Dari hasil Rf
yang diperoleh tidak sama dengan data Rf pada handbook. Hal ini dapat
disebabkan oleh kesalahan
pada saat membuat lapisan silika gelnya, membuat sampel larutan, suhu saat kromatografi serta penetesan sampel
yang tidak merata serta jaraknya terlalu dekat .
XI. KESIMPULAN
1.
Pada Pembuatan lapis tipis,
plat kacanya yang digunakan harus benar-benar
terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya
kromatografi.
2.
Kromatografi
merupakan salah satu cara untuk melakukan pengidentifikasikan suatu asam amino salah satunya kromatografi lapis tipis.
3.
Dengan
menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen (fase gerak)nya adalah
etanol.
4.
Pengidentifikasian
asam amino dengan melihat noda atau bintik yang
dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan
cara membandingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan
jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat.
5.
Untuk
memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan
larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya karena terjadi ikatan kompleks Cu- ninhidrin
yang berwarna.
XII.
DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, 1982. Dasar-Dasar
Biokimia. Jakarta: ERLANGGA
Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI
Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta :
UI Press
XIV. JAWABAN PERTANYAAN
1.
menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi
lapis tipis satu dimensi. Sautu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung
berapa harga Rfnya?
Jawab :
25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen,
kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2
cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan
diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur
dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu
ditotolkan dengan asam amnio, masing-masing adalah alanini, tripthofan, dan
arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah
diisi dengan eluen (etanol 95%). Stelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan
engan ninhidrin dan dikeringkan kemabli selama 30 menit. Kemudian disemprotkan
kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah
sebagai berikut serta harga Rf nya :
Dari hasil pengamatan
diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan
untuk asam amino adalah :
Harga Rf =
Maka :
1. Pada Arginin,
2. Pada Asam Glutamat,
3. Pada Alanin,
2. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!
3.
Sebutkan factor-faktor yang
mempengaruhi Rf pada KLT?
Jawab :
Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak
penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).
4. Terangkan bagaimana orang melakukan
analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis?
Jawab :
Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam eetanol
kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak
sebagai noda-noda coklat.
Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga
noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya.
Bahan sample ditotolkan pada salah satu
sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lempeng
kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan
arah tegak luus dari arah semula.’
5. Terangkan bagaimana cara melakukan
kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara
itu?
Jawab:
Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini,
sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm,
kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama
selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang
dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2.
setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang
kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan
hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut,
dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar